1. Метод исследования – это способ научного познания действительности.
2. Наблюдение – изучение объектов живой природы в естественных условиях существования.
3. Описание – сбор, анализ и изложение данных и их характеристик.
4. Измерение – определении количественных характеристик изучаемого объекта.
5. Эксперимент – ученый изменяет условия и наблюдает, как они влияют на живые организмы.
6. Микроскопия – изучение объектов с использованием микроскопа.
7. Спектрофотометрия – изучение спектров поглощения в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра.
7. Центрифугирование – разделение объектов разной плотности или массы за счет разной скорости оседания объектов.
9. Хроматография – распределение веществ между двумя фазами – неподвижной и подвижной.
10. Рентгеноструктурный анализ – основан явлении рассеяния электромагнитного излучения в изучаемом веществе.
11. Метод меченых атомов – основан на замещении ключевого элемента одним из его радиоактивных изотопов.
12. Секвенирование – определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности биополимеров.
13. Электрофорез – это способ разделения молекул, путем помещения их в электрическое поле.

1) Микроскопия – это исследование при помощи микроскопа. Различают оптическую, многофотонную, рентгеновскую, лазерную и электронную. Цель этого способа исследования заключается в увеличенном наблюдении за объектом и регистрацией замеченных изменений. 

2) Метод меченых атомов. Г.Е. Владимиров (1901-1960), известный биохимик, одним из первых применил радиоактивные изотопы (меченые соединения) для изучения обменных процессов в нервной и мышечной тканях. Меченые атомы (изотопные индикаторы) – изотопы, по своим свойствам (радиоактивности, атомной массе) отличающиеся от других изотопов данного элемента, которые добавляют к химическому соединению или смеси, где находится исследуемый элемент. Поведение меченых атомов характеризует поведение элемента в исследуемом процессе. В качестве меченых атомов используют как стабильные (устойчивые) изотопы, так и радиоактивные (неустойчивые) изотопы. 

Для регистрации радиоактивных меченых атомов применяют счетчики, ионизационные камеры; нерадиоактивные изотопы регистрируют с помощью масс-спектрографов. Принцип, лежащий в основе использования радиоактивных индикаторов, заключается в том, что атом в химическом соединении заменяется другим атомом того же химического элемента. Замещающий атом, однако, является радиоактивным изотопом. Этот процесс часто называют радиоактивным маркированием.Изотопный индикатор (также “изотопный маркер” или “изотопная метка”) используется в химии и биохимии, чтобы помочь понять химические реакции и взаимодействия. В этом методе один или несколько атомов интересующей молекулы замещаются атомом одного и того же химического элемента, но другого изотопа (например, радиоактивного изотопа, используемого при радиоактивном отслеживании). 

Поскольку меченый атом имеет такое же количество протонов, он будет вести себя почти точно так же, как и его немеченый аналог, и, за редким исключением, не будет вмешиваться в исследуемую реакцию. Разница в количестве нейтронов, однако означает, что его можно обнаружить отдельно от других атомов того же элемента.Преимущество метода обусловлено тем фактом, что радиоактивный распад гораздо более энергичен, чем химические реакции. Таким образом, радиоактивный изотоп может присутствовать в низкой концентрации, и его присутствие может быть обнаружено чувствительными детекторами излучения, такими как счетчики Гейгера и сцинтилляционные счетчики. 

Джордж де Хевеси в 1943 году получил Нобелевскую премию по химии “за работу по использованию изотопов в качестве индикаторов при изучении химических процессов”. Таким образом, метод меченых атомов основан на определении количества накапливаемого органе помеченного радиоизотопами вещества – через 2, 6 и 24 ч после приема внутрь. Он позволяет оценить функцию органа. С помощью датчика, устанавливаемого над органом, измеряют радиоактивность в ней и определяют в процентах, какую часть она составляет от общей исходной радиоактивности изотопа. Таким образом, можно получить представление, как орган поглощает и удерживает химический элемент, например, щитовидная железа поглощает и удерживает йод. Используется для изучения обмена веществ. 

3) Секвенирование. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот) – определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК или полных геномов организмов. Метод Сэнгера – метод секвенирования (определения последовательности нуклеотидов) ДНК, также известен как метод обрыва цепи. Впервые этот метод секвенирования был предложен Фредериком Сэнгером в 1977 году, за что он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1980 году. 

Данный метод был наиболее распространенным на протяжении 40 лет. В классическом варианте метода Сэнгера одна из цепочек анализируемой ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепочки ферментом ДНК-полимеразой. Реакцию с одной и той же матрицей проводят в четырёх разных пробирках, каждая из которых содержит: праймер, четыре стандартных дезоксинуклеотида, небольшое количество одного из радиоактивно меченных дезоксинуклеотидов (дидезоксирибонуклеотидов), который включается в состав ДНК во время синтеза и позволяет впоследствии визуализировать продукты реакции. У дидезоксирибонуклеотидов отсутствует 3′-гидроксильная группа, поэтому после их включения в цепь дальнейший синтез обрывается. Таким образом, в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом (в соответствии с добавленным дидезоксинуклеотидом). 

После завершения реакции содержимое пробирок разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и проводят авторадиографию гелей. Продукты четырёх реакций формируют «секвенирующую лестницу», которая позволяет «прочитать» нуклеотидную последовательность фрагмента ДНК. Метод Сэнгера позволяет также определять нуклеотидную последовательность РНК, но она предварительно должна быть «переписана» в форме ДНК с помощью обратной транскрипции. На сегодняшний день секвенирование ДНК по Сэнгеру полностью автоматизировано и проводится на специальных приборах, секвенаторах. Автоматизация значительно ускорила процесс секвенирования и позволила осуществить секвенирования целых геномов, включая геном человека. Таким образом, секвенироване это определение аминокислотной или нуклеотидной последовательности белков или нуклеиновых кислот. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. 

4) Хроматографический метод. Метод основан на их различной способности к адсорбции. М.С. Цвет пропускал вытяжку из листа через стеклянную трубку заполненную порошком – мелом или сахарозой (хроматографическую колонку). Отдельные компоненты смеси пигментов различались по степени адсорбируемости и передвигались с разной скоростью, в результате чего они концентрировались в разных зонах колонки. Разделяя колонку на отдельные части (зоны) и используя соответствующую систему растворителей, можно было выделить каждый пигмент. Оказалось, что листья высших растений содержат хлорофилл а и хлорофилл b, а также каротиноиды (каротин, ксантофилл и др.). Хлорофиллы, так же как и каротиноиды, нерастворимы в воде, но хоро¬шо растворимы в органических растворителях. Хлорофиллы а и b различаются по цвету: хлорофилл а имеет сине-зеленый оттенок, а хлорофилл b – желто-зеленый. Содержание хлорофилла а в листе примерно в три раза больше, чем хлорофилла b. Хроматография – метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами – неподвижной (твёрдая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). 

Метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их перемещения в системе не смешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. В химическом анализе хроматография – это лабораторный метод разделения смеси. Смесь растворяется в жидкости (газе или растворителе), называемой подвижной фазой, которая переносит ее через систему (колонку, капиллярную трубку, пластину или лист), на которой закреплен материал, называемый неподвижной фазой. Различные компоненты смеси имеют разное сродство для стационарной фазы. Различные молекулы дольше или короче остаются в неподвижной фазе, в зависимости от их взаимодействия с ее поверхностными участками. Таким образом, они движутся с различными кажущимися скоростями в подвижной жидкости, заставляя их разделяться. Разделение основано на дифференциальном разделении между подвижной и стационарной фазами. Незначительные различия в коэффициенте разделения соединения приводят к дифференциальному удержанию на стационарной фазе и, таким образом, влияют на разделение.  Хроматография может быть препаративной или аналитической. 

Целью препаративной хроматографии является разделение компонентов смеси для последующего использования и, таким образом, является формой очистки. Аналитическая хроматография обычно проводится с меньшим количеством материала и предназначена для определения присутствия или измерения относительных пропорций анализируемых веществ в смеси. Хроматография была впервые разработана в России ученым итальянского происхождения Михаилом Цветом в 1900 году. Он разработал метод, придумал хроматографию, в первом десятилетии 20-го века, в первую очередь для разделения растительных пигментов, таких как хлорофилл, каротины и ксантофиллы. Хроматографию упрощённо можно рассматривать как последовательность непрерывных ступеней уравновешивания, происходящих в ходе процесса разделения. В небольшой секции колонки («тарелке») устанавливается равновесие между количеством вещества в подвижной и неподвижной фазах, которое описывается константой распределения К, характерной для данного типа вещества. Далее та часть вещества, которая находится в подвижной фазе, переносится с её потоком к следующей секции колонки. Здесь также происходит установление равновесия между фазами. 

5) Рентгеноструктурный анализ – один из дифракционных методов исследования структуры вещества. В основе данного метода лежит явление дифракции рентгеновских лучей на трёхмерной кристаллической решётке. Метод позволяет определять атомную структуру вещества, включающую в себя пространственную группу элементарной ячейки, её размеры и форму, а также определить группу симметрии кристалла. Рентгеноструктурный анализ и по сей день является самым распространённым методом определения структуры вещества в силу его простоты, универсальности (применим для исследования любых молекул) и относительной дешевизны. Таким образом, рентгеноструктурный анализ применяется для исследования структуры вещества. В основе данного метода лежит явление дифракции рентгеновских лучей на трёхмерной кристаллической решётке. В биологии применялся, например, при изучении трехмерной структуры молекулы ДНК, третичной структуры белков. 

6) Спектрофотометрический анализ. Молекулы, имеющие одинаковую связь и образующие одну группу, в ИФ области выдают полосы поглощения соответствующей характеристической частоты. Данные характеристические частоты помогают определить по получаемому спектру имеющиеся в исследуемой взвеси наличие искомых групп атомов или молекул. Делят спектрофотометрию: на молекулярную, когда искомое вещество молекулярная структура, и атомную. Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200-400 нм), видимой (400-760 нм) и инфракрасной (760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии, – зависимость интенсивности поглощения (как правило, измеряется оптическая плотность – логарифм светопропускания, т.к. она зависит линейно от концентрации вещества) падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах). Приборы спектрофотометрии – спектрофотометры. 

7) Электрофорез. Электрофорез – это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Электрофорез применяют в лечебных целях в физиотерапии. Электрофорез – это электрокинетическое явление перемещения частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего электрического поля. Впервые было открыто профессорами Московского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 году. С помощью электрофореза удаётся покрывать мелкими частицами поверхность, обеспечивая глубокое проникновение в углубления и поры. Электрофорез применяют в лечебных целях в физиотерапии. В химической промышленности он используется для осаждения дымов и туманов, для изучения состава растворов и др. Электрофорез является одним из наиболее важных методов для разделения и анализа компонентов веществ в химии, биохимии и молекулярной биологии. 

Одним из методов для подтверждения подлинности анализируемого белка и наличия белковых примесей в исследуемом образце является электрофоретическое исследование. Электрофорез занимает центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры, пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд. Наиболее часто метод используют для аналитических целей – для разделения смеси заряженных веществ на фракции с последующим качественным и количественным их определением. Таким способом удается разделить, например, белки сыворотки крови на 5 фракций: альбумин и 4 фракции глобулинов. Эту задачу часто решают в клинической биохимии, так как соотношение фракций закономерно изменяется при многих патологических процессах. 

8) Биохимический метод. Биохимический метод – основной метод в биохимии из основных методов диагностики различных заболеваний, которые вызывают нарушение обмена веществ. Объектами диагностики биохимического анализа являются: кровь; моча; пот и другие биологические жидкости; ткани; клетки. Биохимический метод исследования позволяет определять активность ферментов, содержание продуктов метаболизма в различных биологических жидкостях, а также выявлять нарушения в обмене веществ, которые обусловлены наследственным фактором.

9) Дифференциальное ультрацентрифугирование. Центрифугирование – это метод, применяемый в цитологии, который представляет собой разделение органоиды или биополимеры клетки на фракции по плотности при помощи центробежных сил. Центрифугирование осуществляется в аппаратах, называемых центрифугами. 

10) Использование флуоресцентных белков. В качестве генов-маркеров при исследованиях эукариотических организмов очень удобно использовать флуоресцентные белки. Ген первого флуоресцентного белка, зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein, GFP) был выделен из медузы Aqeuorea victoria и внедрен в различные модельные организмы. В 2008 году О. Симомура, М. Чалфи и Р. Тсьен получили Нобелевскую премию за открытие и применение этого белка. Затем были выделены гены других флуоресцентных белков – красного, синего, желтого. Эти гены были модифицированы искусственно, чтобы получить белки с нужными свойствами. 

11) Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Еще один метод получения генов. В его основе лежит способность ДНК-полимераз достраивать вторую нить ДНК по комплементарной нити, как это происходит в клетках при репликации ДНК. Точки начала репликации в этом методе задаются двумя небольшими фрагментами ДНК, называемыми затравками, или праймерами. Эти затравки комплементарны концам интересующего гена на двух цепях ДНК. Сначала хромосомную ДНК, из которой надо выделить ген, смешивают с затравками и нагревают до 99 градусов. Это приводит к разрыву водородных связей и расхождению нитей ДНК. После этого температуру понижают до 50-70 градусов (в зависимости от длины и последовательности затравок). В этих условиях затравки присоединяются к комплементарным участкам хромосомной ДНК, образуя правильную двойную спираль. После этого добавляют смесь всех четырёх нуклеотидов, нужных для синтеза ДНК, и ДНК-полимеразу. Фермент удлиняет затравки, строя двуспиральную ДНК от места прикрепления затравок, т.е. от концов гена, до конца одноцепочечной хромосомной молекулы. Если теперь снова нагреть смесь, то хромосомные и вновь синтезированные цепи разойдутся. 

После охлаждения к ним снова присоединятся затравки, которые берутся в большом избытке. На вновь синтезированных цепях они присоединятся не к тому концу, с которого начинался первый синтез, а к противоположному, так как цепи ДНК антипараллельны. Поэтому во втором цикле синтеза на таких цепях достроится только последовательность, соответствующая гену. В данном методе применяется ДНК-полимераза из термофильных бактерий, способная выдерживать кипячение и работающая при температурах 70-80 градусов, её не надо добавлять каждый раз, а достаточно внести в начале опыта. Повторяя процедуры нагрева и охлаждения в той же последовательности, мы можем в каждом цикле удваивать число последовательностей, ограниченных с двух концов внесёнными затравками. После примерно 25 таких циклов число копий гена увеличится более чем в миллион раз. Такие количества легко можно отделить от внесённой в пробирку хромосомной ДНК и использовать для различных целей. 

12) Секвенирование ДНК. Ещё одним важным достижением является разработка методов определения последовательности нуклеотидов в ДНК – секвенирования ДНК (от англ. sequence – последовательность). Для этого необходимо получить чистые от других ДНК гены одним из описанных методов. Затем цепи ДНК разделяют нагреванием и прибавляют к ним затравку, меченую радиоактивным фосфором или флуоресцентной меткой. Обратите внимание, что берётся одна затравка, комплементарная одной цепи. Затем добавляется ДНК полимераза и смесь из 4-х нуклеотидов. Такая смесь делится на 4 части и к каждой добавляется один из нуклеотидов, модифицированный так, что у третьего атома дезоксирибозы он не содержит гидроксильной группы. Если такой нуклеотид включится в синтезируемую цепь ДНК, то её удлинение не сможет продолжаться, т.к. полимеразе некуда будет присоединять следующий нуклеотид. Поэтому синтез ДНК после включения такого нуклеотида обрывается. Таких нуклеотидов, называемых дидезоксинуклеотиды, добавляется значительно меньше, чем обычных, поэтому обрыв цепи происходит лишь изредка и в каждой цепи в разных местах. В результате получается смесь цепей разной длины, на конце каждой из них стоит один и тот же нуклеотид. Таким образом длина цепи соответствует номеру нуклеотида в изучаемой последовательности, например, если у нас был адениловый дидезоксинуклеотид, а полученные цепи имели длину 2, 7 и 12 нуклеотидов, значит в гене во второй, седьмой и двенадцатой позиции стоял аденин. 

Полученную смесь цепей легко разделить по размерам при помощи электрофореза, а синтезированные цепи выявить по радиоактивности на рентгеновской плёнке. Получается картина, называемая радиоавтографом. Двигаясь по нему снизу вверх и читая буква над колонками каждой зоны мы получим последовательность нуклеотидов. Оказалось, что синтез останавливается не только дидезоксинуклеотидами, но и нуклеотидами, у которых в третьем положении сахара присоединяется какая-нибудь химическая группа, например флюоресцентный краситель. Если каждый нуклеотид пометить своим красителем, то зоны, получаемые при разделении синтезированных цепей, будут светиться разным светом. Это позволяет проводить реакцию в одной пробирке одновременно для всех нуклеотидов и разделяя полученные цепи по длине, идентифицировать нуклеотиды по цвету.